在《刺客信条：兄弟会》中，马里奥来接应刚从密室出来的，艾吉奥并回到了庄园。1500年1月，教宗之子切萨雷·波吉亚领兵对蒙泰利吉欧尼庄园发动攻击。切萨雷于城破之时夺回艾吉奥伯父马里奥·奥迪托雷（马里奥Auditore）保管之伊甸圣器“金苹果”，枪杀了马里奥。40岁的艾吉奥负伤带领佣兵及家人逃走后独自前往意大利首都罗马，艾吉奥联结市内♯♯、盗贼及佣兵势力，以及招揽反抗的市民加入兄弟会以对抗在教宗势力控制下的罗马波奇亚家族。在把切萨雷的财源和军队瓦解以及把达芬奇的战争机器毁灭后，最终成为全罗马最大的投资人。艾吉奥于1503年潜进梵蒂冈圣天使城堡夺回“金苹果”。1507年3月艾齐奥前往西班牙纳瓦拉（Navarre）并于围城战中与切萨雷进行最后决斗，艾吉奥把切萨雷击败了，并将其从城墙上投下。最后把碎片藏在罗马圆形剧场附近一密室内，等待后人发现。
表面上和她的上司vidic都同属圣殿骑士（Templar）的机构——名为Abstergo的实验室，实际上她和主角一样也是一名刺客。她是个温柔的女人，曾经被3个持枪的男人绑架，殴打，逼供，WarrenVidic救了她，所以虽然她认为教授对她很凶，而且不是好人，但她仍然感激教授的救命之恩，当然，感激并不代表她不会试图破坏教授的计划，事实上她从一开始就在努力破坏教授的计划。
一名调酒师，Altair的直系后代，实际是刺客组织的一员，从小被养父母软禁，因为受不了刺客组织封闭的生活而逃走，当了一名调酒师，没怎么见过世面，朋友也没几个，但最后还是被圣殿骑士所发现，并抓到Abstergo进行记忆回溯实验。每天早上进虚拟机提取祖先的记忆，晚上偷看邮件和露西聊天。后来得到祖先的鹰眼能力，并且与露西一起逃脱。二人为了阻止圣殿骑士的阴谋，回到现代刺客组织继续寻找祖先的记忆，从而开始了本作的故事。
艾吉奥的叔叔，也是艾吉奥进入刺客行列的领路人，导师。马里奥表面是功勋卓著的雇佣兵长贵族，真实身份却是刺客头目，游戏开始时切萨雷·波吉亚之子切萨雷波吉亚带兵攻陷了蒙特里久尼，马里奥被杀。
文艺复兴时期的佛罗伦萨贵族，是刺客组织的成员。她是艾吉奥，意大利刺客导师的妹妹。
在1476年，克劳迪娅成为她叔叔领导下的蒙特利久尼城的财务会计。这座城在克劳迪娅的管理和从重开的商店、组织赚来的钱下变得繁荣起来。
在1500年1月，蒙特利久尼被在切萨雷·博吉亚指挥下的博吉亚军围攻并被大面积破坏，使得奥迪托雷家族无家可归。有违她哥哥让克劳迪娅和母亲去故乡佛罗伦萨的期望，克劳迪娅和母亲玛丽亚跟随艾吉奥到了罗马。在那里，她成为了盛开蔷薇——罗马最有名妓院的老板娘。
最终，在证明了她对她哥哥来说是一个有价值的战士之后，艾吉奥让克劳迪娅加入刺客组织。第二年，克劳迪娅被博吉亚顽固分子俘获。后来他被艾吉奥和马基雅维利救出。在这段时间她辞去了盛开蔷薇老板娘的职务，和她的朋友保拉呆在佛罗伦萨休养直到1507年。
克劳迪娅在1510年，当他哥哥启程去中东旅行，寻找传说中据说在马斯亚夫的阿泰尔的图书馆时，被授予意大利刺客的临时控制权直到她哥哥在1512年晚些时候回来。之后艾吉奥退出刺客组织并指派了一名继承者。
出场于前作《刺客信条2》，帮助过艾吉奥，于1498年销声匿迹，后在罗马出现，并在罗马城西南经营了一家客栈，收容当地的盗贼。Vople对马基雅维利极其的不信任，一直怀疑其是内奸。
著名政治哲学家、音乐家、诗人、和浪漫喜剧剧作家。其代表作《君主论》在政治学史上有着举足轻重的地位。在游戏中马基亚维利是一个貌奸实忠的人，有着上层社会的身份，却实则阿萨辛刺客集团罗马分支首领。常在暗地里帮助艾吉奥却屡遭误解。最后真相大白，马基雅维利将刺客集团首领的位置交给艾吉奥，潜心著作去了。
亚历山大六世教皇与情妇的私生子，1475年9月13日出生于罗马，1507年3月12日在西班牙的维亚纳死于同朱利叶斯二世教皇的战争中（游戏中是被艾吉奥从城堡扔下摔死），时年三十一岁。切萨雷是《刺客信条兄弟会》的最终BOSS，游戏开始时他就联合法军，攻占了蒙特里久尼，杀死了马里奥，打伤了艾吉奥，抢走了“苹果”。自此，切萨雷成了刺客集团的首要猎杀目标，但因切萨雷生性狡诈，居无定所，还一度离开罗马不知去向，给刺客集团的猎杀行动造成了很大的困难。后刺客集团通过刺杀切萨雷身边的重要人物来剪除其党羽，也使得其不得不再度现身。切萨雷杀死了自己的父亲——亚历山大六世教皇，而在亚历山大六世教皇死后，切萨雷也迅速失势。政敌Giuliano捉拿了切萨雷，并将其流放至西班牙，但切萨雷很快脱逃。4年后，在维亚纳被时任教皇朱利叶斯二世大军逼迫的穷途末路的切萨雷最终被艾吉奥杀死。
原名Roderic Llançol，也曾叫Roderic de BorjaiBorja，是西班牙红衣主教，也是圣殿骑士的首领。他是胡安·波吉亚，切萨雷·波吉亚，卢克雷齐娅·波吉亚和杰弗里·波吉亚的父亲，乔瓦尼·波吉亚的祖父。
他于1492年至1503年担任教皇，被称作亚历山大六世。他是文艺复兴时期最富争论性的教皇之一，他的家族也成为了那个时期教廷腐败的代名词。
在本作中，罗德里格开始淡出，虽然罗德里格名义上是教皇，大权已然落在了切萨雷手中。然而罗德里格对这个非嫡子掌权表现出极大的不满，发现切萨雷贪得无厌远胜于自己当年。父子间矛盾越演越烈，最后罗德里格对儿子痛下杀手，却不成功，反被切萨雷毒死（历史上罗德里格死因不明）。
刺客组织的一员，亦是威尼斯和罗马雇佣兵首领。作为一名训练有素、忠心不二的斗士并统有数量可观的雇佣兵，巴尔托洛梅奥对刺客组织而言是一位宝贵的人才。
他在威尼斯的时候与艾吉奥·奥迪托雷（后成为意大利刺客导师）结交，二人协力从西尔维奥·巴尔巴里戈手中夺回了巴尔托洛梅奥的故乡——城堡区。西尔维奥这名圣殿贵族一度对这片土地主张权利。巴尔托洛梅奥参加了艾吉奥正式加入刺客组织的仪式；他还在艾吉奥潜入梵蒂冈时助其一臂之力，使卫兵忙于应付他在罗马城制造的事故而无暇阻止艾吉奥。
巴尔托洛梅奥与艾吉奥再次在罗马会面时，他与妻子潘塔西利娅·巴廖尼已经驻进了阿尔维阿诺营地。巴尔托洛梅奥在这里对抗博吉亚军队和奥克塔维安·德·瓦卢瓦率领的法国士兵。他与艾吉奥并肩战斗，成功削弱了博吉亚势力，使刺客得以解放这座城市。
巴尔托洛梅奥同样在若干只意大利军队服役，因其果敢的性格和精湛的剑术而名声远播。他在阿尼亚德洛之战中失利。被释放后他继续自己的军事生涯，直至在围攻赫迪（Ghedi）时遭遇最后的败绩。
一个博学的意大利人：解剖学家，雕塑家，制图员，画家，植物学家，工程师，建筑师，数学家，音乐家，科学家，发明家，地质学家，生物学家和作家。列奥纳多被称为文艺复兴时期人们的典范——十分好奇且极具想象力。他被全世界的学者，工程师和艺术家广泛认为是有史以来最伟大的思想家，同时也是最多才多艺的人。
莱昂纳多在刺客与圣殿骑士之间的斗争中扮演了一个重要的角色，这在他有生之年中传遍了他的家乡，并始终与佛罗伦萨的艾吉奥·奥迪托雷保持着亲密朋友与盟友的关系。